Hormon làm giảm Glucose máu – Đường huyết

Insulin

Đặc điểm chung

Insulin do tế bào beta (B) của đảo tuỵ Langerhans tiết ra. Tế bào B chủ yếu có ở phần trước đầu, thân và đuôi tuỵ (70 – 80%), phần sau đầu tuy chỉ có 15 – 20%. Các tế bào beta nằm ở trung tâm của đảo tuỵ, dòng máu chảy từ trung tâm mang theo hàm lượng insulin cao ra ngoại vi sẽ ức chế các tế bào A bài tiết glucagon.

ở người, gen điều hoà bài tiết insulin nằm trên cánh tay ngắn của nhiễm sắc thể thứ 11. Dưới sự điều khiển của ADN/ARN, hệ võng nội mô của tế bào beta sẽ tiết ra preproinsulin có trọng lượng phân tử là 11.500. Các enzym trong ty lạp thể sẽ tách preproinsulin thành proinsulin với trọng lượng phân tử là 9.000. Các proinsulin dự trữ trong các hạt của bộ Golgi, khi các hạt đã chín sẽ tách ra 1 phân tử insulin và 1 peptid C.

• Proinsulin

Trong máu luôn tồn tại insulin và một số hạt proinsulin không bị tách ra. Đây là điểm cần lưu ý vì một số huyết thanh kháng insulin dùng trong miễn dịch phóng xạ có phản ứng chéo với proinsulin (người ta sẽ lầm với insulin), tỷ lệ này vào khoảng từ 3 đến 5%. Các proinsulin tồn tại trong máu gấp 3 – 4 lần insulin. Chúng không bị hoá giải ở gan, nhưng lại bị hoá giải ở thận.

• Peptid c

Gồm 31 acid amin, có trọng lượng phân tử xấp xỉ 3000, không có hoạt tính sinh học. Peptid c không bị hoá giải ở gan và bị hoá giải ở thận.

• Insulin

Là một protein gồm 51 acid amin, được chia thành 2 chuỗi alpha (gồm 21 acid amin) và beta (gồm 30 acid amin), chúng nối vổi nhau bằng các cầu nối s – s. Trọng lượng phân tử của insulin người là 5808. Thời gian bán huỷ của insulin là 3 – 5 phút. Insulin được dị hoá ở gan, thận và nhau thai, khoảng 50% insulin bị dị hoá mỗi khi đi qua gan.

Bình thường mỗi ngày tuỵ tiết ra từ 40 – 50 đơn vị (U) insulin. Nồng độ cơ bản của insulin trong máu vào khoảng 10 µU/ml (tương đương với 0,4 ng/ml hay 69 μmol/l), để đảm bảo nồng độ glucose trong huyết tương được duy trì ở giới hạn từ 4,4 -5,3 mmol/l (80-95mg/dl). Nồng độ insulin cơ bản trong huyết tương cũng đảm bảo duy trì sự bài tiết glucose của gan với tỷ lệ là 1,9-2,1mg/kg/phút (=10-12μmol/l/ kg/phút).

Tác dụng của insuIin

• Tác dụng lên các tế bào lân cận cụ thể là tế bào A ở ngoại vi đảo tuy, khi insulin được dòng máu đưa đến sẽ có tác dụng làm các tế bào này giảm khả năng bài tiết glucagon.

Tuy nhiên cần phải lưu ý rằng các loại và số lượng hormon do đảo tuỵ tiết ra phụ thuộc vào thành phần thức ăn. Ví dụ carbohydrat chỉ kích thích tế bào B (tiết ra insulin) và D (tiết ra somatostatin), các acid amin khác kích thích bài tiết cả insulin và glucagon. Khẩu phần ăn càng nhiều carbohydrat, glucagon càng tiết ít. Nếu nhiều đạm, glucagon được tiết nhiều hơn (do các acid amin kích thích lên tế bào A rất có hiệu quả, đặc biệt khi không có tăng glucose máu).

• Tác dụng lên tế bào ở xa (tác dụng nội tiết):

Lên gan :

+ Tác dụng đồng hoá: Tăng thu nhập glucose từ máu vào gan (đặc biệt khi nồng độ glucose tăng cao sau bữa ăn), tăng tổng hợp, dự trữ glycogen, nhưng lại ức chế giáng hoá glycogen. Gan dự trữ vào khoảng từ 100 đến 110 gam glycogen gần bằng 440 Kcal. Ngoài ra insulin còn tăng tổng hợp protein, triglycerid và tạo ra các VLDL, ức chế tạo ra glucose tân tạo.

+ Tác dụng dị hoá ức chế phân giải glycogen, sinh ceton và tân tạo glucose.

Lên cơ:

+ Tăng sinh tổng hợp và dự trữ protein, nhưng lại ức chế thoái hoá protein do đó làm giảm tốc độ giải phóng acid amin ra khỏi tế bào, đặc biệt tế bào cơ.

+ Tăng thoái hoá glucose ở cơ.

+ Tăng dự trữ glycogen ở cơ.

Lên mô mỡ: Tăng kích thích tổng hợp triglycerid (TG) bằng nhiều cơ chế:

+ Tăng sản xuất enzym lipoproteinlipase, enzym này gắn vào nội mạc mao mạch thuỷ phân triglycerid từ các lipoprotein lưu hành.

+ ức chế thuỷ phân triglycerid dự trữ trong tế bào bằng cách ức chế enzym lipase nội bào.

+ Tăng chở glucose vào tế bào mỡ.

+ Tăng tổng hợp acid béo và vận chuyển acid béo đến mô mỡ.

Bảng 3.1. Tóm tắt vai trò sinh lý của insulin.

	Tình trạng tăng insulin sau ăn	Tình trạng insulin thấp (lúc đói)
Gan	Thu nhận glucose Tổng hợp glucogen Tổng hợp lipid Mất khả năng tạo thể ceton , Mất khả năng tổng hợp glycogen	Sản xuất glucose Phân huỷ glycogen Mất khả năng tạo mỡ Tổng hợp thể ceton Phân huỷ glycogen
Cơ	Thu nhận glucose Oxy hoá glycose Tổng hợp glycogen Tổng hợp protein nền	Mất khả năng thu nhận glucose, oxy hoá acid béo, thể ceton Phân huỷ glycogen Phân huỷ protein và tiết acid amin
Mô mỡ	Thu nhận glucose Tổng hợp lipid Thu nhận triglycerid	Mất khả năng nhận glucose Phân huỷ lipid và bài tiết acid béo tự do Mất khả năng nhận triclycerid

Như vậy chính sự giảm insulin trong huyết tương đã làm tăng tạo các acid béo tự do, làm tăng nồng độ acid béo tự do trong tuần hoàn, tăng tạo thê ceton trong gan, hậu quả là tăng thể ceton máu, gây tình trạng nhiễm toan – ceton. Đây là điểm quan trọng đặc biệt trong cơ chế bệnh sinh của bệnh đái tháo đường.

• Các protein vận chuyển glucose (GLUT)

Glucose là nguồn cung cấp năng lượng chính cho nhiều tế bào, nhất là tế bào não. Nhưng màng tế bào não lại không cho glucose đi qua, muốn qua được phải nhờ các protein vận chuyển.

Cho tới nay người ta đã biết sự phân phối các loại protein ở các vùng hoạt động khác nhau và vị trí của gen tổng hợp chúng trên các nhiễm sắc thể (bảng 3.2).

Bảng 3.2. Một số gen liên quan tổng hợp protein vận chuyển glucose.

Tên	Vùng hoạt dộng chính	Ái lực với glucose	Gen ở NST
GLUT 1	Mạch não, hồng cầu, các mô	Cao, km = 1mmol/l	1
GIUT2	Gan, tế bào beta, niêm mạc ruột thận	Thấp, km 15-20	3
GLUT3	Neuron não, các mô	Cao, km <1mmol/l	12
GLUT4	Tế bào cơ, mỡ	Trung bình, km=2,5 – 5	17
GLUT5	Hỗng tràng, gan, tinh trùng	Trung bình, km = 6	1

km là mức glucose máu mà tại đó protein chuyên chở đạt 1/2 khả năng chở cao nhất. Như vậy km tỷ lệ nghịch với ái lực.

Thụ thể insulin:

• Cấu trúc của thụ thể insulin là một protein gồm 2 chuỗi:

+ Chuỗi alpha nhúng vào dịch ngoại bào, có trọng lượng phân tử (TLPT) là 130.000. Chuỗi này có 2 điểm trên 2 cánh tay gắn với Insulin.

+ Chuỗi beta cài sâu vào màng bào tương, có TLPT 90.000. Chuỗi này chứa tyrosinkinase là enzym khởi động chuỗi các hoạt động của thụ thể.

• Có 2 kiểu hoạt động:

+ Kiểu 1: Tyrosin kinase bị hoạt hoá dẫn đến chuỗi các phản ứng của quá trình phosphoryl hoá, cảm ứng các protein nội bào như chất vận chuyển glucose 4 (GLU – 4), transferrin, thụ thể LPL, yếu tố tăng trưởng giống insulin (IGF – 2). Các chất này di chuyển đến bề mặt tế bào, giúp cho mô nhạy cảm với insulin hơn đồng thời cũng giúp cho sự tăng trưởng. Những khiếm khuyết di truyền sau thụ thể sẽ dẫn đến vấn đề kháng insulin sau thụ thể. Nhiều nghiên cứu cho thấy có đột biến gen của thụ thế isulin ở người có kháng insulin

+ Kiểu 2: insulin kích hoạt các phospholipase c làm thuỷ phân glucolipid màng tế bào. Các chất thông tin thứ 2 như inositol, monophosphat, diacyglycetol là các chất trung gian đáp ứng insulin. Diacyglycetol hoạt hoá proteinkinase c sẽ kích thích tình trạng phosphoryl hoá nội bào.

Các bất thường tại thụ thể, như về nồng độ thụ thể, về ái lực hay cả hai đều làm thay đổi tác dụng của insulin. Insulin tăng cao, kéo dài sẽ làm suy giảm sốlượng thụ thể ở bề mặt tế bào (do làm giảm thụ thể nội bào).

Các yếu tố điều hoà bài tiết insulin

• Glucose máu:là yếu tố cơ bản kích thích tiết insulin.
• Yếu tố ức chế bài tiết insulin

Yếu tố thần kinh (Catecholamin).

Yếu tố dịch thể (Somatostatin).

Thuốc như diazoxid, phenintoin, vinblastin, colchicin.

• Nồng độ calci máu

Các hạt chứa insulin nằm dọc theo các ống vi thể, khi nồng độ calci nội bào tăng làm các ông co thắt phóng thích các hạt.

Có lẽ nồng độ glucose tác dụng theo hướng này vì:

Glucose kích thích tế bào beta, làm tăng thu nạp glucose.

Glucose cũng làm sự di chuyển calci trong tế bào chậm lại.

Vai trò của AMP vòng: Calci ra khỏi ty lạp thể khi glucose tăng và có tăng AMP vòng (lưu ý, nếu không có tăng glucose, chỉ có tăng AMP vòng đơn độc sẽ không làm tăng tiết insulin).

Những cơ chế khởi động, gia tăng, các kho hạt, bài tiết hai pha insulin

Cơ chế khởi động

Đáp ứng với tăng nồng độ glucose máu, tế bào beta tuyến tụy sẽ bị kích thích bài tiết insulin. Đáp ứng này được đặc trưng bằng pha đầu xảy ra ngay sau tác động kích thích của glucose và tiếp theo là pha thứ hai kéo dài.

• Pha thứ nhất, pha giải phóng là do khởi động con đường phụ thuộc kênh nhạy cảm với ATP (K_ATp) làm tăng [Ca²⁺]i và được cho là làm bài tiết các hạt từ “nguồn đã có, sẵn sàng giải phóng”. Pha này phản ánh khả năng dự trữ của tế bào.
• Pha thứ hai, phản ánh khả năng chuẩn bị insulin dự trữ trong các hạt để chờ giải phóng. Đây cũng chính là pha phản ánh khả năng sản xuất insulin của tế bào beta. Những con đường chịu trách nhiệm cho pha thứ hai hoạt động bình thường bao gồm con đường phụ thuộc kênh K_atp vì sự cần thiết tăng [Ca²⁺]i và các tín hiệu bổ sung từ các con đường không phụ thuộc kênh K_ATp. Những cơ chế làm cơ sở của các tín hiệu bô sung này chưa được biết. Những giả thiết hiện nay bao gồm tăng acyl- CoA chuỗi dài của bào tương, vận chuyển pyruvat-maleat, bài xuất glutamat từ ty lạp thể và tăng tỷ số ATP/ADP.

ở các tiểu đảo của chuột, tế bào beta chứa khoảng 13.000 hạt, trong đó khoảng 100 hạt ở trong nguồn “sẵn sàng giải phóng”. Các tốc độ giải phóng hạt thường là chậm, ví dụ như một hạt cần 3 giây, thậm chí ngay tại đỉnh của pha đầu giải phóng insulin do được kích thích bởi glucose. Vì cả hai pha bài tiết insulin được kích thích bởi glucose có thể được tăng lên bởi các tác nhân khác, như peptid giống glucagon-1 (làm tăng mức AMP vòng và hoạt tính của protein kinase A) hoặc acetylcholin (làm tăng mức diacylglycerol và hoạt tính protein kinase C). Vì thế một giả thuyết duy nhất về “nguồn sẩn sàng giải phóng” chưa đủ và chưa phải là một giải thích hợp lý về bài tiết insulin. Giả thuyết về nhiều nguồn hạt có sẵn cho giải phóng nhanh hoặc chuyển nhanh các hạt sang trạng thái sẵn sàng giải phóng đang được nghiên cứu là hướng cần thiết.

Sự hiểu biết của chúng ta về những cơ chế tham gia vào sự kết nối kích thích- bài tiết ở tế bào beta tụy đã tăng lên đáng kể trong 10-15 năm gần đây. Từ năm 1984 người ta đã nhận diện được kênh K⁺ nhạy cảm với ATP (kênh K_AXP) và biết rằng nguyên nhân gây khử cực của tế bào beta là do thay đổi nồng độ glucose ngoại bào và lượng ATP nội bào. Đóng kênh này làm tăng Ca²⁺ vào trong tế bào và kích thích giải phóng insulin. Con đường này được miêu tả như con đường phụ thuộc kênh K_ATp.

Năm 1992 một số các công trình nghiên cứu đã chứng minh sự tồn tại của một con đường khác “không phụ thuộc” kênh K_ATp. Con đường này không làm tăng [Ca2+ ]i nhưng làm tăng mạnh đáp ứng bài tiết khi [Ca2+ ]i tăng lên bởi các cách khác. Con đường này (và có thể nhiều con đường khác nữa) thường được miêu tả là con đường không phụ thuộc kênh K_atp, nhưng chúng hoạt động đồng vận với con đường phụ thuộc kênh K_atp. Điều này có nghĩa là con đường này không độc lập nghiêm ngặt với kênh K_ATP. Con đường phụ thuộc kênh K_ATP đảm bảo sự tăng lên của [Ca2+]i , con đường không phụ thuộc kênh K_ATP làm tăng đáp ứng đối với sự tăng lên của [Ca²⁺]i . Sự đòi hỏi [Ca²⁺]i cho cả hai con đường phù hợp với thực tế rằng tăng [Ca2+]i là rất quan trọng đối với kích thích bài tiết insulin.

Nhưng sau đó, nhờ những thực nghiệm khác, chúng ta lại thấy rằng glucose có thể làm tăng bài tiết insulin ở các tiểu đảo của chuốt đã bị làm cạn kiệt Ca²⁺ trong điều kiện vắng mặt hoàn toàn của Ca²⁺ ngoại bào và không có bất kỳ sự tăng lên nào của [Ca2+]i. Tác động làm tăng glucose hoạt động tốt nhất khi protein kinase (PK) A và c của tế bào beta cùng được hoạt hóa tối đa. Trong những điều kiện này, tăng glucose có thể xảy ra ở mức [Ca²⁺]i rất thấp. Vai trò sinh lý của con đường mới này là có thể, tuy chưa được chứng minh, là do sự kết hợp của peptid hoạt hóa adenylylcyclase tuyến yên (PACAP) với carbachol – hai chất hoạt hóa PKA và PCK tương ứng. Sự kết hợp này đã thúc đẩy làm tăng giải phóng insulin khi không có bất kỳ sự tăng lên nào của [Ca2+]i ở cả tế bào HIT và tiểu đảo của chuột. Tiểu đảo tụy in vivo được kích thích không phải chỉ bởi glucose hay những đồng vận đơn lẻ, mà đồng thời bởi nhiều đồng vận, bao gồm các acid amin, các acid béo, acetylcholin, PACAP, polypeptid hướng insulin phụ thuộc glucose (GIP), peptid giống glucagon- 1 (GLP-1) và một số các đồng vận khác. Vì thế, con đường này có thể có vai trò sinh lý trong kiểm soát bài tiết insulin.

Con đường này có thể được miêu tả không phụ thuộc kênh K_ATp, không phụ thuộc Ca²⁺; ngược với con đường không phụ thuộc kênh K_atp, phụ thuộc Ca²⁺được phát hiện vào năm 1992. Người ta cũng chứng minh rằng con đường không phụ thuộc kênh K_ATp làm tăng bài tiết insulin được kích thích bởi mastoparan ở các tiểu đảo của cả người và chuột. Dường như là trong những tình huống đa dạng này, những con đường làm gia tăng có những cơ chế tương tự.

Cho tới nay có 4 con đường gắn với 4 giai đoạn đã được xác định rõ của sự kết nối kích thích-bài tiết của tế bào beta.

(1) Khử cực (khởi động): Có hai khả năng:

* Bằng con đường phụ thuộc kênh K_ATP:

Tăng nồng độ glucose và các chất dinh dưỡng khác, gây khử cực thông qua đóng kênh K_ATp, tăng lượng Ca²⁺ vào trong tế bào qua các kênh Ca²⁺ phụ thuộc điện thế, tăng [Ca²⁺]i và tăng tốc độ xuất bào (tốc độ bài xuất insulin).

Sự thay đổi của điện thế màng có liên quan đến điều hoà đóng mở các kênh K_AXp, thông qua vai trò các kênh calci. Insulin sẽ bài tiết khi kênh calci mở, kênh kali đóng và ngược lại. Thông thường ở trạng thái nghỉ điện áp màng được duy trì ở mức (-70 mV), lúc này trong tế bào nồng độ ATP giảm, ADP tăng, kênh calci đóng và kênh K_ATp mở. Khi nồng độ glucose trong máu tăng, lượng glucose vào tế bào cũng tăng, qua chu trình Krebs, lượng ATP tăng, ADP giảm, kênh calci mở dòng Ca⁺² ùa vào trong tế bào.

* Bằng tăng nồng độ arginin:

Khử cực trong trường hợp này là kết quả của sự di chuyển của các acid amin tích điện dương qua CAT2A – một chất vận chuyển acid amin ion dương, đi vào trong tế bào.

(2) Gia tăng tốc độ:

Bằng con đường không phụ thuộc kênh K_ATp phụ thuộc Ca²⁺ chịu tác động của glucose:

Con đường này tác động ở vị trí xa đối với sự tăng lên của [Ca²⁺ ]ị. Những cơ chế hoạt động này chưa được xác định, ngoài ra còn có một số cơ chế khác, trong số đó có sự tăng nồng độ malonyl CoA do glucose, sự ức chế transíerase carnitin palmitoyl, giảm oxy hóa acid béo và tăng acid béo chuỗi dài của bào tương. Chất cuối này có khả năng tác động trực tiếp hoặc gián tiếp như những nửa tín hiệu, có nghĩa là làm hoạt hóa các chất đồng dạng PKC mà chúng có thể kích thích xuất bào hoặc tác động thông qua palmitoyl hóa hoặc các phản ứng acyl hóa khác. Giả thiết malonyl CoA hiện nay còn là vấn đề tranh luận cũng như các câu hỏi về con đường vận chuyển pyruvat-malat, glutamat và tỷ số ATP/ADP .

Bằng con đường không phụ thuộc kênh K_ATp không phụ thuộc Ca²⁺ chịu tác động của glucose:

Vấn đề là có phải con đường này cũng là con đường không phụ thuộc kênh K_ATp (phụ thuộc Ca²⁺⁾ đã được miêu tả trước đây hay nó là một con đường mới khác biệt?). Con đường mới này chỉ hoạt động có hiệu quả đầy đủ trong điều kiện có mặt PKC được hoạt hóa tối đa.

Nếu trường hợp đầu là đúng thì có ít nhất hai hệ quả:

• Sự hoạt hóa kết hợp của PKA và PKC giống hệt như tác động của tăng [Ca2+]i.
• Những con đường làm gia tăng tác động vào những đích khác nhau, có nghĩa là những con đường tham gia vào xuất bào mà không được khởi động bởi Ca²⁺ . Khả năng có thể nhất của trường hợp sau này sẽ là xuất bào phụ thuộc GTP (Guanosin triphosphat). Sự gia tăng phụ thuộc Ca²⁺ bởi glucose kháng lại sự giảm hàm lượng GTP trong tế bào của acid mycophenilic, trong khi sự gia tăng không phụ thuộc Ca²⁺ bị huỷ bởi sự xử lý này.

Phát hiện này làm nảy sinh hai tình huống:

• Những cơ chế gia tăng bao gồm các bước phụ thuộc GTP và:
• Chỉ có một con đường gia tăng glucose, nhưng nó tác động vào hai cơ chế tách biệt mà theo đó Ca²⁺ và GTP có thể kích thích một cách độc lập vào quá trình xuất bào ở tế bào beta.

Khái niệm về một protein G (Ge) kiểm soát xuất bào, lần đầu tiên được mô tả vào năm 1986, đã được phát triển đầy đủ mặc dù thực tế là Ge còn chưa được nhận diện, cả hai protein gắn GTP heterometric và phân tử lượng thấp đều tham gia vào kiểm soát quá trình chuyển vị và xuất bào. Thêm vào đó, mastoparan, một tetradecapeptid tinh khiết từ nọc độc ong bắp cày với khả năng hoạt hóa các protein G kích thích sự giải phóng insulin theo cách không phụ thuộc Ca²⁺ và sự kích thích này cũng được gia tăng bởi glucose.

(3) Hoạt hóa các phospholipase và PKC:

Những con đường này được hoạt hóa bởi các hormon như acetylcholin. Tăng tốc độ quay vòng của phosphoinositid đã huy động lượng calci dự trữ làm tăng [Ca2+]i và tăng sản xuất diacylglycerol (DAG), làm hoạt hoá các đồng dạng PKC.

Con đường này có tác động thúc đẩy quan trọng hiện tượng kích thích quá trình bài tiết insulin.

(4) Kích thích hoạt tính của adenyl cyclase và hoạt hoá PKA:

Những con đường này được hoạt hóa bởi các hormon như peptid hoạt mạch ruột (VIP), PACAP, GLP-1 và GIP. Những hormon này, khi hoạt động sẽ tác động qua Gs (một protein gắn với GTP). Gs có 3 tiểu đơn vị là a, (3, y;. Người ta đặc biệt chú ý đến Gs, vì nó kích thích adenyl cyclase, gây tăng AMP vòng và hoạt hoá PKA. Tăng hoạt tính của PKA sẽ làm tăng khả năng bài tiết insulin.

Tuy nhiên, cũng có nhiều bằng chứng cho thấy có thể còn có những con đường khác, phát các tín hiệu khác kích thích cho các đồng vận làm hoạt hóa Gs.

Kho hạt sẵn sàng giải phóng và dự trữ insulin ở tế bào beta

Rõ ràng là sự kích thích giải phóng insulin bởi thậm chí một chất kích thích bài tiết như glucose cũng do sự tương tác phối hợp nghiêm ngặt của nhiều yếu tố tham gia tác động lên quá trình di chuyển của các hạt. Qúa trình này luôn diễn ra theo một trình tự:

• Cắt ngắn về gần màng bào tương.
• Chuẩn bị giải phóng (động tác mồi) và:
• Bài tiết insulin ra khỏi tế bào (hiện tượng xuất bào).

Trong tế bào beta, tổng số các hạt chứa insulin dư thừa rất nhiều so với số lượng cần để kiểm soát glucose máu của một bữa ăn. Điển hình là chỉ một phần trăm nhỏ các hạt (hay của lượng insulin) của tế bào beta được bài tiết khi cần đáp ứng với kích thích của glucose. Sự phức tạp của quần thê các hạt trong tế bào beta còn chưa được hiểu rõ, nhưng có thể được miêu tả dưới dạng 3 nguồn:

• Nguồn dự trữ.
• Nguồn cắt ngắn về hình thái (các hạt tiếp xúc với màng bào tương).
• Nguồn sẵn sàng giải phóng.

Trong mô hình này nguồn cắt ngắn về hình thái chứa các hạt ở các trạng thái sẵn sàng khác nhau (được mồi và không được mồi) và các hạt sẵn sàng được giải phóng cũng có mối liên hệ phức tạp. Sự phức tạp của nguồn dự trữ có thể được suy luận từ thực tế là các hạt chứa insulin mới tổng hợp dễ được bài tiết hơn so với các hạt khác.

Số lượng các hạt nguồn dự trữ lớn hơn so với nguồn sẵn sàng giải phóng. Ớ tế bào beta của chuột tổng quần thể các hạt được ước tính bằng định lượng hình thái vào khoảng 13.000.

Số lượng các hạt sẵn sàng giải phóng, được đánh giá bằng các nghiên cứu điện dung, có vào khoảng 40 – 100 hạt, tức là chỉ chiếm khoảng 0,3 – 0,7% của tổng số hạt. Vì nguồn sẵn sàng giải phóng liên quan đến pha đầu giải phóng insulin được kích thích bởi glucose, rõ ràng là pha kéo dài thứ hai giải phóng insulin được kích thích bởi glucose phải bao gồm sự chuyển vị các hạt từ các nguồn dự trữ sang nguồn sẵn sàng giải phóng hoặc sự chuyển dạng các hạt cắt ngắn về hình thái sang khả năng giải phóng trước khi xuất bào.

Người ta nghiên cứu đáp ứng bài tiết insulin đối với nồng độ glucose là 16,7 mmol/l ở các tiểu đảo của chuột. Tốc độ bài tiết được biểu diễn bằng hàm lượng insulin được giải phóng trong một phút. Kết quả là tốc độ bài tiết insulin có thể tính bằng số hạt được giải phóng bởi một tế bào beta “trung bình” trong một phút. Phương pháp sau này được tính toán từ tổng số các hạt trong tế bào beta chuột (13.000 hạt) và sự giả định rằng các tế bào chứa cùng một số lượng hạt và hàm lượng insulin như nhau. Khi được biểu diễn bằng cách này có thể thấy rằng tại đỉnh của pha đầu bài tiết insulin tế bào beta chuột giải phóng ra các hạt với tốc độ khoảng một hạt là 3 giây. Trong thời gian pha thứ hai tốc độ giải phóng kéo dài hơn, tế bào beta giải phóng hạt với tốc độ một hạt là 10 giây, ớ pha thứ hai, dù kéo dài bài tiết insulin bởi glucose, nhưng chỉ có 6 trong số 13.000 hạt trong tế bào được kích thích để xuất bào mỗi phút. Kiến thức về các tốc độ này là rất quan trọng để hiểu được cơ chế và quá trình kiểm soát sự bài tiết insulin.

Trong các nghiên cứu định lượng đo hình thái bằng hình ảnh hiển vi điện tử của tế bào beta-HC9 (dòng tế bào beta từ chuột) người ta thấy rằng trên 10% số hạt nằm trong giới hạn của màng bào tương bằng một đường kính của hạt thông thường, có nghĩa là các hạt có thể được miêu tả như là được cắt ngắn về hình thái. Sẽ là hợp lý khi giả định rằng một lượng nhỏ các hạt sẵn sàng giải phóng nằm trong nguồn này và các hạt cắt ngắn về hình thái có thể chuyển sang trạng thái có khả năng sẵn sàng giải phóng khi cần. Người ta cũng thấy rằng nguồn cắt ngắn về hình thái tương tự trong tế bào beta chuột cũng bao gồm 10% tổng số hạt trong tế bào. Nếu 1.300 hạt cắt ngắn về hình thái là những hạt đảm bảo pha thứ hai giải phóng tiếp theo nguồn sẵn sàng giải phóng thì có thể tính được rằng chúng có thể duy trì pha thứ hai giải phóng (với tốc độ 6 hạt từ mỗi tế bào trong một phút) trong hơn 3,5 giờ. Vậy là để thay thế các hạt đã bài tiết và để giữ nguồn cắt ngắn về hình thái được nạp đầy, sự chuyển vị của 6 hạt trong một phút là đủ.

Xuất bào ở tế bào beta tụy (giả thuyết về bài tiết insulin của tế bào beta)

Theo giả thuyết thụ thể gắn protein (N-ethylmaleimide-sensitive factor (NSF) attac henzym protein receptor = SNARE) của yếu tố nhạy cảm với N-ethylmaleinmid (NSF) hòa tan, quá trình cắt ngắn và xuất bào các hạt bao gồm sự hình thành một “phức hợp nhân” của syntaxin và protein kết hợp synaptosomal -25 (SNAP-25) từ màng bào tương. Các quá trình bổ sung bao gồm các cơ chế mồi hoặc chuyển sang trạng thái sẵn sàng giải phóng. Ó những tế bào với sự bài tiết được điều chỉnh, xuất bào xảy ra khi có hoạt hóa tế bào. Những quá trình này chưa được xác định rõ và bao gồm những sự tương tác nhiều khâu vôi các protein phụ, những thay đổi hình thái của phức hợp và các khâu phụ thuộc Ca²⁺ và ATP.

Tuy đây là những đặc điểm chung trong tất cả các hệ thống bài tiết được nghiên cứu (bao gồm các hệ bài tiết nhanh nhất như ở các synap thần kinh và các hệ bài tiết chậm như ở tế bào beta), các tốc độ xuất bào rất khác biệt nhau nói lên rằng sự kiểm soát xuất bào ở các typ tế bào khác nhau cũng sẽ khác nhau. Dù có những khác biệt này, những mô hình và giả thiết có thể được phát triển và sử dụng như cơ sở của các thực nghiệm chung đã giúp chúng ta có được những tiến bộ nhất định trong khi nghiên cứu về quá trình xuất bào của tế bào beta tuyến tuỵ.

Sự xuất bào đòi hỏi sự tương tác giữa V-SNARE VAMP-2 và syntaxin của t-SNARE và SNAP-25. Ba protein này kết hợp thông qua các tương tác, tạo thành một phức hợp hết sức bền vững trước khi xuất bào. Những vai trò riêng rẽ của các đồng dạng syntaxin khác trong tế bào beta còn chưa được biết. Tương tự như thế, vai trò của SNAP-23, mà có thể thay thế bằng SNAP-25 nhưng có hiệu quả chậm hơn, cũng còn cần được tiếp tục nghiên cứu. Người ta cũng thây các protein khác tham gia vào vòng xuất/nhập bào bao gồm các a- và P-SNAP, NFS và munc-18.

Như ta đã biết Ca²⁺ cần thiết cho một số bước trong quá trình cắt ngắn, quá trình chuẩn bị giải phóng( động tác mồi) và xuất bào, còn các protein đích ứng cử đã được nhận diện bởi các vùng gắn đặc hiệu tương ứng. Tuy còn có ít hiểu hiết về những vai trò chính xác của những protein này trong xuất bào, nhưng có những gợi ý hấp dẫn về khả năng hên quan của chúng. Ví dụ như sự gắn Ca²⁺ vào CAPS cho phép gắn phospholipid; munc-13 gắn Ca²⁺ với DAG và tương tác với doc-2 được xem là có vai trò tiềm tàng giải phóng insulin bởi các chất hoạt hóa của phospholipase c như acetylcholin.

Calmodulin và CaM kinase II có nhiều vai trò chưa được phát hiện trong quá trình phosphoryl hóa các protein chủ chốt. Tầm quan trọng của synaptotagmin nhạy cảm với Ca²⁺ đã được chứng minh bằng các nghiên cứu ở chuột và ruồi giấm. Ở tế bào beta tuỵ của chuột syntaxin 1A, 4 và 5; SNAP-25; VAMP-2 và munc-18 đã được nhận diện. Trong các dòng tế bào P-TC6-Í7 và HIT-T15 và trong các tiểu đảo tuy cellubrevin và VAMP-2 chứ không phải VAMP-1 đã được tìm thấy, cũng như có SNAP-25, các đồng dạng của syntaxin 1-4, synaptotagmin III và munc-18.

Các nghiên cứu khác bao gồm synaptotagmin III, rabphilin và rab3A và cellubrevin. Đã có bằng chứng rằng syntaxin 1 chứ không phải syntaxin 2 tham gia vào xuất bào.

Thực tế mà các đồng dạng của các protein tương tác được bộc lộ một cách biệt hóa ở các typ tế bào khác nhau nhấn mạnh tính phức tạp của các tương tác phân tử tham gia vào quá trình xuất bào.

Tất cả tính đa dạng này buộc chúng ta phải ghi nhận rằng giữa các typ tế bào khác nhau đều có những biến đổi riêng lẻ, bên cạnh những đặc điểm đồng dạng đặc trưng. Những ví dụ rõ ràng về tính không chắc chắn bao gồm vai trò chính xác của các đồng dạng của synaptotagmin mà chắc chắn nhất là một chất cảm nhận Ca²⁺và munc-18 được cho là có tác dụng ngăn chặn syntaxin gắn với SNAP-25. Nhưng thực tế nó có thể có nhiều chức năng, chứ không phải là chỉ có một chức năng kiểm soát xuất bào. Các đồng dạng của synaptotagmin III và IV có mặt ở các tế bào beta và sự thể hiện quá mức gây ra tăng nhạy cảm với Ca²⁺. Câu hỏi được đặt ra là trong những điều kiện cụ thể nào thì chức năng tương ứng nào phát huy tác dụng chính yếu của nó?

Người ta đã dùng cách tiếp cận kết hợp sinh lý và hóa sinh để nghiên cứu nguồn hạt sẵn sàng giải phóng và thấy rằng nguồn này có thê được phát hiện trong các mảng tế bào bị phân huỷ bằng lắng đọng miễn dịch của syntaxin và xét nghiệm Western blot đối với VAMP-2 lắng đọng miễn dịch kết hợp. Khi insulin được bài tiết nhanh do glucose trong 5-10 phút tạo thành pha đầu giải phóng, nguồn hạt sẵn sàng giải phóng – đánh giá bằng xét nghiệm Western blot đối với VAMP-2 – bị giảm đi rất nhiều và đôi khi không phát hiện được khi so sánh với các tế bào không bị kích thích. Tiếp theo, thậm chí trong sự có mặt liên tục của glucose ở nồng độ 16,7 mmol/l, nguồn hạt sẵn sàng giải phóng dần dần được nạp đầy trong pha thứ hai.

Những dữ liệu này cho phép giả thiết rằng tốc độ bài tiết insulin trong pha thứ hai không bị hạn chế bởi sự sẵn có của các hạt có thể phát hiện được bằng cách này mà bị giới hạn bởi tốc độ các hạt được chuẩn bị để giải phóng (được mồi). Nguồn hạt sẵn sàng giải phóng có thể được bài tiết bởi các chất kích thích bài tiết gây giải phóng nhanh insulin, ví dụ như bởi nồng độ gây khử cực của KCI hay bởi mastoparan, với sự giảm tương tự hay mất khả năng được phát hiện. Sự tiết nguồn hạt sẵn sàng giải phóng bởi glucose và các kích thích khác với tác động cấp tính bị chẹn bởi các chất ức chế giải phóng insulin như norepinephrin.

Tuy nhiên, từ những dữ liệu về giải phóng insulin trong những điều kiện khác nhau, khác với sự giải phóng do bị kích thích bởi glucose đơn độc, có thể khẳng định, khái niệm về nguồn sẵn sàng giải phóng đơn lẻ là không hợp lý. Ví dụ như tác động của nồng độ kích thích của glucose vào các tiểu đảo trong sự hiện diện của GLP-1, PACAP, VIP hay GIP hay các chất hoạt hóa khác của adenylyl cyclase sẽ gây ra pha đầu giải phóng lớn hơn so với chỉ do glucose đơn độc. Vì với sự hiện diện của nhiều yếu tố tham gia như vậy, chỉ có thể giải thích hoặc là có nhiều nguồn hạt sẵn sàng giải phóng hoặc có những nguồn có thể chuyển sang trạng thái sẵn sàng giải phóng (ví dụ như AMP vòng) với tốc độ cực nhanh.

Trình tự tác động của nồng độ cao glucose vào quá trình bài tiết insulin và nguồn hạt sẵn sàng giải phóng:

Trong những thí nghiệm được miêu tả, các tế bào P-HC-9 được ủ trong nồng độ glucose 0,1mmol/l và sau đó được tác động bởi glucose ở nồng độ 30 mmol/l trong 60 phút. Tốc độ bài tiết insulin được theo dõi trong những khoảng cách nhau 1 phút. Các mảnh tế bào phân huỷ được chuẩn bị và gây lắng đọng miễn dịch bằng kháng thể kháng syntaxin tại các thời điểm 0, 10 và 60 phút – những thời điểm tương ứng với trạng thái nền, điểm cuối của pha đầu bài tiết insulin và sau đó ở pha thứ hai bài tiết insulin.

Kiểu đáp ứng với pha đầu bài tiết đạt đỉnh ở phút thứ 5 và kết thúc vào phút thứ 10 và hình cao nguyên kéo dài của quá trình giải phóng tăng lên. Một nguồn hạt sẵn sàng giải phóng được phát hiện tại thời điểm 0 (trạng thái nền) nhưng được bài tiết rất nhiều ở điểm cuối của pha đầu vào thời điểm 10 phút. Sau đó, như được đánh giá bằng sự lắng đọng miễn dịch kết hợp của VAMP-2 tại phút thứ 60, nguồn hạt đã được nạp lại. Tuy nhiên, nguồn hạt không còn là sẵn sàng giải phóng, có nghĩa là không được giải phóng với tốc độ như ở pha đầu. Trong thời gian pha thứ hai giải phóng do kích thích bởi glucose, từ 10 – 60 phút, tốc độ nạp lại các hạt từ các nguồn dự trữ vào nguồn mà người ta có thể phát hiện bằng lắng đọng miễn dịch kết hợp vượt tốc độ xuất bào ở các hạt và dẫn đến sự nạp lại nguồn hạt. Nguồn được nạp lại, được thấy ở phút 60 được phát hiện bằng lắng đọng miễn dịch kết hợp, không được giải phóng tức thì bởi kích thích của glucose hiện tại và được chứng minh là gây ra tăng liên tục nồng độ Ca²⁺nội bào.

Câu hỏi được đặt ra là dường như chính sự mất khả năng của kích thích của glucose làm tăng tốc độ bài tiết trong thời gian pha thứ hai tới mức bằng vổi pha đầu, mặc dù có sự hiện diện của nguồn hạt có cùng kích thước với nguồn hạt sẵn sàng giải phòng được phát hiện ở 0 phút, có thể là thời gian cần để mồi các hạt để giải phóng sau khi chúng tới nguồn này?.

Để kiểm tra khả năng này, người ta đã tác động vào các tế bào p- HC-9 một lượng glucose là 30 mmol/l trong 5 phút để gây ra pha đầu giải phóng và bài tiết nguồn hạt sẵn sàng giải phòng; trở về glucose 0,1 mmol/l trong 15 phút tiếp theo (để loại bỏ kích thích) và sau đó kích thích lại bằng glucose 30 mmol/l trong 5 phút tiếp theo. Các mảnh tế bào phân huỷ được chuẩn bị từ các tế bào ở trạng thái nền tương tứng tại 10 và 30 phút. Tác động bằng glucose 30 mmol/l gây ra, như dự tính, pha đầu bài tiết insulin. Loại bỏ kích thích bằng glucose ở phút 15 làm giảm giải phóng insulin tới mức nền. Kích thích bằng glucose ở phút 30 gây ra một “pha đầu khác” bài tiết insulin.

Một nguồn hạt sẵn sàng giải phóng, được phát hiện rõ ràng ở trạng thái nền ở thời điểm 0, đã được bài tiết bởi 5 phút kích thích bằng glucose ở nồng độ 30 mmol/l, có nghĩa là tại đỉnh của pha đầu bài tiết insulin. Sau khi các tế bào trở về trạng thái nền (0,1 mmol/l glucose), nguồn hạt sẵn sàng giải phóng được tái sinh vào phút 30 và lại được bài tiết bởi kích thích của glucose. Vì thế, dường như có khả năng nhất là pha đầu bài tiết insulin là do một nguồn hạt được mồi và “sẵn sàng giải phóng”. Bởi vì nguồn được mồi được bài tiết nhanh trong pha đầu, pha thứ hai bài tiết phải là do các hạt được chuyển vị từ nguồn dự trữ (có thể là chỉ chuyển dạng từ nguồn cắt ngắn về hình thái) và phải được mồi trước khi chúng có thể được giải phóng. Như thế, tốc độ giải phóng insulin ở pha thứ hai bị chi phối bởi tốc độ các hạt được mồi. Trong khi các nghiên cứu này được thực hiện trên dòng tế bào beta chuột giống hệt đáp ứng của tiểu đảo của chuột, có nghĩa là với hình cao nguyên của pha thứ hai bắt đầu ngay sau điểm thấp nhất của pha đầu, rất đáng chú ý để áp dụng sự lý giải thế này đối với các đáp ứng thấy được ở các tiểu đảo chuột hoặc ở người mà ở đó tốc độ giải phóng insulin tăng lên từ điểm thấp nhất đến cao nguyên cao hơn. Trong những trường hợp này, sự phát triển của đáp ứng này sẽ do sự tăng dần lên của tốc độ hạt được mồi sau khi tới nguồn giải phóng nhưng không phải là “sẵn sàng” giải phóng.

Như đã trình bày ở trên, khái niệm về một nguồn sẵn sàng giải phóng đơn độc của các hạt chứa insulin không giải thích được một cách thỏa đáng tình huống khi pha đầu bài tiết insulin do kích thích bởi glucose có thể có tiềm năng ngay tức thì bởi các chất hoạt hóa adenylyl cyclase hoặc PKC. Cũng còn cần thiết phải giải thích đáp ứng pha đầu tăng tức thì trong những trường hợp này. Các khả năng có thể có bao gồm:

– Nhiều nguồn hạt sẵn sàng giải phóng cần hoặc là tăng PKA hoặc PKC kết hợp với tăng [Ca2+ ]i (được đảm bảo bởi kích thích của glucose) cho giải phóng nhanh.

– Khả năng của PKA và PKC chuyển những nguồn hạt đặc hiệu (cắt ngắn về hình thái?) sang trạng thái sẵn sàng giải phóng. Đây là một vấn đề quan trọng cho nghiên cứu sau này.

Tóm lại, một nguồn sẵn sàng giải phóng của các hạt chứa insulin chịu trách nhiệm cho pha đầu giải phóng insulin được kích thích bởi glucose. Sau khi bài tiết trong pha đầu, sự nạp lại diễn ra bằng cách chuyển vị các hạt từ các nguồn dự trữ với tốc độ vượt quá tốc độ giải phóng insulin ở pha thứ hai. Như thế, tốc độ giải phóng insulin trong pha thứ hai không được quyết định bởi tốc độ chuyển vị các hạt.

Cuối cùng, cần phải thừa nhận rằng những cơ chế kiểm soát bài tiết insulin ở pha đầu không ít phức tạp hơn so vơí những cơ chế kiểm soát pha thứ hai, vì thực tế là chúng như nhau. Tuy nguồn sẵn sàng giải phóng các hạt chứa insulin đã sẵn sàng để giải phóng, những cơ chế tham gia vào chuẩn bị các hạt cũng giống như các cơ chế chuẩn bị các hạt để giải phóng trong pha thứ hai. Như thế, sự chuyển vị các hạt đến màng bào tương, cắt ngắn về hình thái, chuẩn bị cho giải phóng, mồi và xuất bào đều tuân theo một trình tự tương tự các sự kiện. Sự khác nhau duy nhất có khả năng là ở chỗ các hằng số tốc độ bài tiết.

Các chất đưa tin kiểm soát pha đầu giải phóng được kích thích bởi glucose là ATP và ADP, điện thế màng, [Ca2+ ]i và các chất cảm nhận Ca²⁺ – bất kỳ chúng là gì. Các chất truyền tin kiểm soát pha thứ hai giải phóng cũng giống như đối với pha đầu, ATP và ADP, điện thế màng, [Ca2+]i và các chất cảm nhận Ca²⁺. Tuy nhiên, chúng được kết hợp thêm với các tín hiệu gây ra bởi glucose mà có thể bao gồm CoA citrat và manolyl, các acetyl CoA chuỗi dài, diacyl glycerol, các đồng dạng PKC, các phosphokinase và các phosphoinositid. Sự đa dạng của các chức năng tham gia vào kiểm soát bài tiết trong pha thứ hai kéo dài đòi hỏi sự đa dạng của các tín hiệu được phối hợp.