Các phương pháp lấy bệnh phẩm để xét nghiệm vi khuẩn
NGUYÊN TẮC CHUNG: lựa chọn bệnh phẩm để yêu cầu xét nghiệm và những test để thử cần phải căn cứ vào một chẩn đoán có khả năng đúng, sau khi đã tìm hiểu bệnh sử và khám lâm sàng. Phải lấy các mẫu bệnh phẩm trước khi cho thuốc kháng sinh. Phải sử dụng kỹ thuật tốt để lấy bệnh phẩm, sử dụng những biện pháp vận chuyển thích đáng, và cung cấp cho phòng xét nghiệm mọi thông tin có ích về tình trạng của bệnh nhân.
KỸ THUẬT LẤY BỆNH PHẨM: giá trị chẩn đoán của xét nghiệm bệnh phẩm phụ thuộc trước hết vào kỹ thuật bảo vệ mẫu bệnh phẩm khỏi bị ô nhiễm ngẫu nhiên hoặc thường xuyên bởi quần thể vi sinh trong cơ thể.
Nhiễm khuẩn nông (da, niêm mạc): xét nghiệm bệnh phẩm chỉ có ích nếu chứng minh được trường hợp nhiễm khuẩn là đặc hiệu (vì bệnh phẩm bị ô nhiễm thường xuyên).
Lấy bệnh phẩm ở họng (hầu): thì sử dụng một tăm bông vô khuẩn, đưa vào qua miệng ở một bên dọc theo mặt trong của má, tới tận trụ của amiđan để tránh không gây phản xạ nôn. Lấy bệnh phẩm ở họng được chỉ định, ví dụ trong bệnh viêm amiđan cấp tính để tìm liên cầu khuẩn tan huyết beta (viêm amidan ban đỏ có bựa), tìm trực khuẩn bạch hầu (viêm họng giả mạc) tìm vi khuẩn phối hợp hình thoi-xoắn khuẩn (viêm họng Vincent) ,
Nhiễm khuẩn ở cơ quan thông thương với bên ngoài, bệnh phẩm phải lấy như đờm, nước tiểu, phân, chất tiết của cổ tử cung bị ô nhiễm là không tránh khỏi, trừ trường hợp lấy bệnh phẩm bằng nội soi. Đe tránh những vi khuẩn ô nhiễm tăng sản, phải diệt khuẩn vùng da quanh những lỗ tự nhiên (mũi, miệng, hậu môn), giữ trong lạnh và ria cấy bệnh phẩm thật nhanh chóng.
Nhiễm khuẩn ở sâu: nếu vô khuẩn da tuyệt đối, thì những bệnh phẩm là máu, dịch não tuỷ, dịch xuất tiết màng phổi, màng bụng hoặc trong khớp, và những mẫu bệnh phẩm lấy bằng chọc sinh thiết hoặc phẫu thuật rạch da, sẽ không bị ô nhiễm.
Cấy máu: phải lấy bệnh phẩm trước khi cho thuốc kháng sinh, nếu lấy trong lúc đang có cơn sốt hoặc cơn tăng nhiệt thì tốt hơn. Nếu bệnh nhân đã được điều trị, thì phải tạo ra một “cửa sổ trị liệu”, tức là ngừng cho thuốc kháng sinh trong vài ngày để phát hiện mầm bệnh. Việc làm lại các xét nghiệm phụ thuộc vào bệnh cảnh lâm sàng. Vô khuẩn da là động tác rất quan trọng để tránh bệnh phẩm bị ô nhiễm. Hiện nay người ta đã chuẩn bị sẵn những lọ để có thể ria cấy đồng thời những mầm bệnh ái khí và kỵ khí. Nếu không thực hiện được ria cấy ngay tại giường bệnh, thì người ta thường lấy 20-30 ml máu vào trong một Ống nghiệm vô khuẩn chứa sẵn 1 ml dung dịch citratnatri 1%, rồi nhanh chóng gửi tới phòng xét nghiệm. Nói chung, cấy máu cho kết quả dương tính sau 24-48 giờ đối với các vi khuẩn thông thường. Nếu là cấy tìm vi khuẩn brucella hoặc leptospira thì phải chờ đợi nhiều ngày, và trong trường hợp sốt kéo dài không biết nguyên nhân, thì phải quan sát kết quả cấy máu trong vòng 3 tuần.
Dịch não tuỷ: lấy 2 ml là đủ để cấy vi khuẩn (4 ml nếu định cấy tìm mycobacterium hoặc nấm men). Dịch não tuỷ phải được xét nghiệm càng nhanh càng tốt và giữ ở 37°c (màng não cầu khuẩn bị chết nếu giữ trong lạnh).
Có thể quan sát phiến đồ nhuộm Giemsa và làm một test kháng miễn dịch điện di (CIE: hoặc miễn dịch điện di khuếch tán) để phát hiện sớm kháng nguyên của vi khuẩn, về chi tiết, xem: dịch não tuỷ
Nước tiểu: xét nghiệm tế bào-vi khuẩn. Nồng độ vi khuẩn niệu được xác định bằng phương pháp nhúng lam kính (“dip sides”). Nếu thấy có trên 100.000 vi khuẩn trong 1 ml nước tiểu thì chắc chắn có nhiễm khuẩn tiết niệu; nếu số lượng này ở giữa -000 và 10.000 thì nhiễm khuẩn tiết niệu là có khả năng. Nếu phát hiện thấy có trên 3 loại vi khuẩn khác nhau thì thường là do bệnh phẩm bị ô nhiễm, về chi tiết, xem: nhiễm khuẩn tiết niệu.
Lấy bệnh phẩm để xác định virus
Vào lúc bắt đầu mắc bệnh do virus, người ta có thể đồng thời phân lập virus bằng nuôi cấy và phát hiện hiệu giá kháng thể tăng lên bằng những test huyết thanh (làm hai lần cách nhau một khoảng thời gian 10-14 ngày)
Ở giai đoạn muộn hoặc vào thời kỳ lại sức, thì test huyết thanh vẫn dương tính, nhưng cấy bệnh phẩm thì âm tính. Bệnh phẩm lấy xong phải mang ngay đến phòng xét nghiệm.
Chẩn đoán vi sinh
QUAN SÁT TRỰC TIẾP PHIẾN ĐỒ DƯỚI KÍNH HIỂN VI: cho phép xác định một số các vi sinh vật hoặc cung cấp những chỉ dẫn sơ bộ có ích để bắt đầu điều trị ngay. Quan sát bệnh phẩm dưới kính siêu hiển vi (kính hiển vi nền đen) là phương pháp chủ yếu để chẩn đoán bệnh giang mai giai đoạn thứ nhất và phần lớn các bệnh do xoắn khuẩn khác. Quan sát trực tiếp cũng có ích trong chẩn đoán các bệnh nấm, bệnh ký sinh trùng đường ruột (xét nghiệm phân), bệnh giun chỉ, và bệnh nhiễm trypanosoma.
QUAN SÁT PHIẾN ĐỒ NHUỘM DƯỚI KÍNH HIỂN VI:
Nhuộm Gram là kỹ thuật phổ biến nhất và có ích nhất để nhuộm phiến đồ các dịch của cơ thể. Những vi sinh vật nào bắt màu tím (bởi tím gentian) được gọi là “Gram dương”, còn nếu bắt màu hồng (bởi fuchsin) thì gọi là “Gram âm”.
Những vi khuẩn mycobacterium sau khi nhuộm bằng thuốc nhuộm carbofuchsin sẽ không bị mất màu nếu tẩy bàng acid mạnh và cồn. Thường trước khi nhuộm bằng phương pháp Ziehl-Neelsen và phương pháp Kinyoun thì người ta hay phát hiện vi khuẩn bằng các phương pháp huỳnh quang, nhất là dùng auramin để nhuộm bệnh phẩm.
Có những phương pháp nhuộm đặc hiệu để phát hiện một số vi sinh vật, ví dụ, phương pháp Wright để phát hiện Pneumocystis carinii, phương pháp Romanowski để phát hiện Leishmania, và phương pháp Warthin- Starry để phát hiện Rochalimaea henselae (gây bệnh mèo cào).
PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH-HUỲNH QUANG
Trực tiếp: kỹ thuật miễn dịch-huỳnh quang trực tiếp kết hợp tính đặc hiệu của các phương pháp miễn dịch học với lợi điểm của phương pháp quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi. Người ta nhuộm phiến đồ bằng những kháng thể đặc hiệu, đánh dấu bởi những hợp chất phát huỳnh quang, nhìn thấy được trực tiếp dưới kính hiển vi dùng tia cực tím. Kỹ thuật này có thể phát hiện được những vi khuẩn nhò kháng thể kết nối với chúng đã được gắn chất phát huỳnh quang. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang đã được sử dụng để phát hiện Chlamydia trong các dịch tiết cô tử cung, niệu đạo, và kết mạc mắt, để phát hiện Legionella pneumophila và Pneumocystis cariniỉ trong đờm và trong dich tiết của phế quản.
Gián tiếp: trong kỹ thuật miễn dịch-hiiỳnh quang gián tiếp, một kháng nguyên đã biết rõ được đưa vào một mẫu huyết thanh để thử (tìm kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên này trong mẫu huyết thanh). Sự hình thành phức hợp kháng nguyên-kháng thể (tức là phản ứng dương tính) sẽ được nhìn thấy dưới kính hiển vi nhờ tác động của một immunoglobulin kháng globulin người gắn chất phát huỳnh quang.
KÍNH HIỂN VI ĐIỆN TỬ: được sử dụng trong những phòng xét nghiệm đặc biệt. Kỹ thuật Miễn dịch Hiển vi Điện tử đã được sử dụng để phát hiện một số virus.
NUÔI CẤY: cấy các vi sinh vật trong các môi trường nhân tạo hoặc trong mô tế bào là phương pháp chắc chắn nhất để xác định chúng. Nếu không nhận được các thông tin đặc biệt từ phía thày thuốc, thì phòng xét nghiệm sẽ sử dụng nhiều môi trường nuôi cấy khác nhau để cấy các tác nhân sinh bệnh phổ biến nhất. Tuy nhiên, để phát hiện một số mầm bệnh, cần phải có một số môi trường đặc biệt. Phần lớn trường hợp nuôi cấy vi khuẩn thông thường đều thấy vi khuẩn mọc sau 24 giờ, nhưng trong một số trường hợp phải ủ môi trường trong tủ ấm trong nhiều tuần.
Xoắn khuẩn gây bệnh giang mai và trực khuẩn gây bệnh phong không thê phân lập được bằng nuôi cấy. Trực khuẩn lao và những mycobacterium không điển hình khác thì được cấy trong môi trường Lowenstein và môi trường Coletsos.
Để phát hiện virus, người ta phải dùng những môi trường là tế bào được nuôi cấy.
TIÊM TRUYỀN CHO ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM (chuột lang, chuột nhắt, V..V..): là phương pháp dùng để phân lập và xác định những vi sinh vật như trực khuẩn lao, (ngày nay ít tiêm truyền cho động vật), trực khuẩn bệnh than, rickettsia, và một số loài nấm. Để phân lập arbovirus, người ta tiêm truyền bệnh phẩm vào não chuột nhắt sơ sinh.
Chẩn đoán huyết thanh
Nói riêng, kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh của bệnh nhân phát hiện bằng những phương pháp miễn dịch học, được coi như bằng chứng bị nhiễm vi sinh vật. Kháng thể xuất hiện có thể là do hoặc chính tác nhân sinh bệnh xâm nhập vào cơ thể và gây ra bệnh đang mắc, hoặc do đối tượng đã bị nhiễm từ trước, nhưng không biểu hiện, hoặc có biểu hiện bởi chính mầm bệnh đó hoặc bởi một mầm bệnh khác (gọi là phản ứng chéo), hoặc bởi đối tượng đã được tiêm chủng vaccin từ trước. Do đó, phải lấy bệnh phẩm hai lần cách nhau một khoảng thời gian 10-14 ngày để chứng minh là hiệu giá kháng thể đặc hiệu tăng lên trong quá trình bệnh. Thật vậy, sự tăng hiệu giá kháng thể có ý nghĩa hơn, so với chính hiệu giá đó, vì giá trị hiệu giá kháng thể cao có thể chỉ là do đối tượng đã bị nhiễm mầm bệnh từ trước.
Người ta dùng thuật ngữ huyết thanh chuyển đổi để chỉ tình trạng hiệu giá của một kháng thể thay đổi từ 0 thành một giá trị dương tính (tức là kháng thể xuất hiện ở một đối tượng trước đó có phản ứng huyết thanh âm tính, điều này có nghĩa là đối tượng bị sơ nhiễm). Ngoài ra, khi thuyết minh kết quả của các phản ứng huyết thanh phải tính đến bôi cảnh lâm sàng và dịch tễ.
Những kỹ thuật phổ biến hiện nay được chọn lựa để dùng cũng phụ thuộc vào các phương tiện kỹ thuật sẵn có và khả năng tài chính cho phép. Một số kỹ thuật tuy đơn giản, nhưng kém đặc hiệu, trong khi những kỹ thuật khác rất đặc hiệu nhưng lại phức tạp và đắt tiền.
TEST VỚI LATEX: Những kháng nguyên hoà tan của vi khuẩn thường được giải phóng vào các dịch của cơ thể (như: huyết thanh, dịch não-tuỷ, nước tiểu). Người ta có thể phát hiện những kháng nguyên trong các dịch này bằng những phương pháp nhanh (ví dụ ngưng kết những hạt latex đã được mẫn cảm). Nhờ phương pháp nhanh này mà người ta đã phát hiện được liên cầu khuẩn nhóm B, Haemophilus influenzae, phế cầu khuẩn, màng não cầu khuẩn, trong những trường hợp bệnh cấp cứu.
PHẢN ỨNG NGƯNG KET: phát hiện được những kháng thể kháng vi khuẩn:
Ngưng kết trực tiếp: Cho vào một dãy ống nghiệm một lượng không thay đổi kháng nguyên của vi khuẩn (vi khuẩn còn sống hoặc đã bị giết bằng formol). Cho kháng nguyên này tiếp xúc với những nồng độ huyết thanh (tức kháng thể của bệnh nhân) tăng dần, và đọc hiệu giá giới hạn ở đó còn quan sát thấy ngưng kết.
Ngưng kết thụ động: kháng nguyên được gắn vào một giá đỡ trơ (hồng cầu, hạt latex V..V..) rồi cho tiếp xúc với huyết thanh bệnh nhân, nếu huyết thanh này có chứa kháng thể đặc hiệu thì sẽ làm ngưng kết hồng cầu hoặc các hạt latex. Nếu giá đỡ trơ là hồng cầu thì người ta gọi test này là test ngưng kết hồng cầu.
PHẢN ỨNG ỨC CHẾ NGƯNG KẾT HỒNG CẦU: Người ta gắn kháng nguyên muốn phát hiện vào những tế bào hồng cầu, sau đó cho các hồng cầu này tiếp xúc với kháng thể đặc hiệu. Nếu không thấy xuất hiện ngưng kết (bị ức chế) thì chứng tỏ có kháng nguyên muốh phát hiện, ngược lại nếu ngưng kết xuất hiện (không bị ức chế) thì có nghĩa là không có kháng nguyên muốn phát hiện.
PHẢN ỨNG LỆCH BỔ THỂ: cho kháng nguyên đã biết tiếp xúc với huyết thanh muốn thử nghiệm và bổ thể. Nếu huyết thanh muốn xét nghiệm có chứa kháng thể đặc hiệu thì bổ thể sẽ gắn vào phức hợp kháng nguyên-kháng thể này.
PHẢN ỨNG TRUNG HOÀ: dựa trên sự ức chế một hiệu quả sinh học (tính di động của một vi sinh vật, hoạt tính của một độc tố V..V..) bởi kháng thể.
Chống miễn dịch-điện di (CIE hoặc điện di miễn dịch khuếch tán): dùng để phát hiện một số kháng nguyên của vi khuẩn. Phản ứng có ích trong chẩn đoán nhanh những trường hợp nhiễm màng não cầu khuẩn, phế cầu khuẩn, Haemophilus influenzae typ B, nhất là ở trẻ em.
Xét nghiệm miễn dịch phóng xạ (Radio Immuno Assay – RIA): là phương pháp định lượng kháng nguyên hoặc để tìm một kháng thể, bằng cách dùng một chất đánh dấu phóng xạ.
KỸ THUẬT ELISA (Enzym-Linked Immuno-Sorbent Assay): là phương pháp miễn dịch-enzym cho phép định lượng những yếu tố của phức hợp kháng nguyên-kháng thể. Kỹ thuật này dùng để chẩn đoán những trường hợp nhiễm Chlamydia, bệnh Lyme, và bệnh giang mai. Xét nghiệm cũng cho phép phát hiện một số virus không thể cấy được, ví dụ, rotavirus, virus viêm gan B, virus bệnh AIDS (HIV). Kỹ thuật “Western blot” được sử dụng để khẳng định một test ELISA dương tính đối với HIV và để xác minh trong huyết thanh muốn xét nghiệm có chứa tất cả những protein cấu trúc của virus không. Còn kỹ thuật “Southern blot” thì được sử dụng để xác định gen trong chẩn đoán những bệnh di truyền.
Sự có mặt một kháng thể đặc hiệu kháng lại một virus thuộc lớp IgM, như vậy chứng tỏ bệnh do nhiễm virus này đang diễn ra hoặc mới khỏi; nhưng sự có mặt của kháng thể đặc hiệu thuộc lớp IgG thì chỉ chứng minh đó là một dấu vết huyết thanh của lần nhiễm virus đã xảy ra từ trước.
PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR hoặc “Polymerase Chain Reaction”): là kỹ thuật cho phép khuếch đại những chuỗi DNA chính xác của một số mầm bệnh, đặc biệt là của virus bệnh AIDS, của Chlamydia, và các mycobacterium.
Test bì (Phản ứng bì): một số nhiễm khuẩn gây ra phản ứng dị ứng kiểu muộn và kéo dài ở da. Các trường hợp nhiễm khuẩn này có thể được phát hiện bằng cách tiêm vào trong da những vi khuẩn đó hoặc kháng nguyên của chúng. Trong vòng 24-48 giờ sau khi tiêm, cơ thể sẽ phản ứng lại bằng vết ban đỏ hoặc nốt cứng ở da.
Test bì được sử dụng để chẩn đoán một số trường hợp nhiễm khuẩn như nhiễm lao, bệnh phong, bệnh do brucella, bệnh tularemia, bệnh do Toxoplasma, bệnh nấm histoplasmin, bệnh nấm blastomyces, săng hạ cam, bệnh sán echinococcus, V.. V…
Phải ghi nhớ rằng, khi kết quả một xét nghiệm âm tính thì cũng chưa được phép loại trừ một trường hợp nhiễm khuẩn đang hiện hữu hoặc đã qua; nhưng nếu thấy một test âm tính chuyển sang dương tính thì đó là dấu hiêu có giá trị của nhiễm lao tiến triển. Nói chung, test bì đặc biệt có ích để phát hiện những trường hợp nhiễm bệnh trong điều tra dịch tễ.